Mắt biếc xoay quanh mối tình đơn phương của Ngạn với Hà Lan, cô bạn gái có cặp mắt hút hồn nhưng cá tính bướng bỉnh. Một chuyện tình nhiều cung bậc, từ ngộ nghĩnh trẻ con, rồi tình yêu thuở học trò trong sáng, trải qua bao biến cố, trở thành một cuộc “đuổi hình bắt bóng” buồn da diết nhưng không nguôi hi vọng. Câu chuyện càng trở nên éo le hơn khi Trà Long - con gái của Hà Lan lớn lên lại nhen nhóm một tình yêu như thế với Ngạn.

Phim lấy bối cảnh ở thập niên 1960 và 1970. Nhân vật chính là Ngạn, cậu bé sinh ra và lớn lên tại ngôi làng Đo Đo, tỉnh Quảng Nam (cũng là nguyên quán của tác giả Nguyễn Nhật Ánh). Cậu yêu mến cô bạn tên Hà Lan, người có đôi mắt đẹp tuyệt trần mà Ngạn tự gọi là "mắt biếc". Cả hai cùng trải qua biết bao nhiêu kỷ niệm tại làng quê nghèo này, dần dần trong Ngạn nảy sinh một tình yêu thầm lặng dành cho Hà Lan. Khi lớn lên, cả hai đều đi học trên thành phố Huế. Hà Lan ở chung nhà với người cô trong khi Ngạn ở chung nhà với cậu Huấn.

Cậu Huấn có một người con trai tên Dũng, là anh họ của Ngạn. Tuy là con nhà giàu, sành điệu và giỏi võ, nhưng Dũng không phải là người đàng hoàng. Một lần Hà Lan qua tìm Ngạn để mượn sách, Dũng đã để ý Hà Lan và từ đó tìm cách tán tỉnh cô, điều này làm Ngạn thấy khó chịu. Không thể cưỡng lại sức hấp dẫn của chốn thành thị xa hoa nên Hà Lan đã ngã vào vòng tay Dũng. Mỗi khi Dũng làm Hà Lan đau khổ, Hà Lan tìm đến tâm sự với Ngạn. Hà Lan như vậy càng khiến Ngạn đau lòng hơn vì điều anh cần chỉ là thấy cô được hạnh phúc. Có lần Ngạn xảy ra ẩu đả với Dũng để rồi bị đánh tơi tả.

Hà Lan mang thai nên phải nghỉ học và dọn đến khu phố khác. Ngạn biết chuyện nên thường đến chăm sóc cô. Trong khi Ngạn luôn bên cạnh chăm sóc Hà Lan thì Dũng đã cưới một cô gái khác tên Bích Hoàng. Hà Lan sinh ra một đứa con gái, đặt tên là Trà Long và gửi về quê cho bà ngoại nuôi. Cuối cùng Ngạn cũng tốt nghiệp, anh trở thành thầy giáo và trở về làng Đo Đo dạy học. Còn Hà Lan mở một tiệm may trên thành phố, cô luôn bận rộn với công việc, hiếm khi có thời gian về thăm. Một cô gái tên Hồng đem lòng yêu Ngạn từ thời đi học, cô cũng về làng Đo Đo dạy học để được ở gần bên anh, tuy nhiên Ngạn chỉ một lòng yêu Hà Lan.

Ngạn đã chăm lo cho Trà Long suốt mười mấy năm, từ lúc cô bé còn nhỏ cho đến khi trở thành thiếu nữ đi học trên thành phố Huế. Trà Long như một bản sao của Hà Lan, làm Ngạn cảm thấy như được sống lại một thời ký ức ngày xưa. Biết rằng Ngạn sẽ không bao giờ yêu mình, Hồng đau khổ dọn vào Sài Gòn sống. Trà Long bắt đầu yêu Ngạn, điều này làm anh bất ngờ. Để tránh mọi chuyện tồi tệ hơn, Ngạn quyết định bỏ đi thật xa. Hai mẹ con Hà Lan đều sốc khi biết Ngạn ra đi. Sau một hồi tâm sự với Trà Long, Hà Lan hiểu rằng cô không nên bỏ lỡ một người yêu mình thật lòng. Hà Lan chạy ra nhà ga để giữ Ngạn lại, nhưng cô không đuổi kịp chiếc xe lửa. Hà Lan đã khóc, và ở trên xe lửa, Ngạn cũng khóc.